ETUDE DE DEUX MARQUEURS DE L'INFLAMMATION TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA ET PHOSPHOLIPASE A2 DANS LES PATHOLOGIES RESPIRATOIRES INFLAMMATOIRES

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE


ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre




MEMOIRE

présenté
par
Christelle LEPORTIER-COMOY
pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes





ETUDE DE DEUX MARQUEURS DE L'INFLAMMATION
TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA ET PHOSPHOLIPASE A2
DANS LES PATHOLOGIES RESPIRATOIRES INFLAMMATOIRES

Soutenu le, 19 décembre 2003 devant le jury suivant :

Dr Marie-Madeleine GIRAUD-GUILLE - Président
Dr Sylvie DEMIGNOT – Rapporteur
Dr Véronique CARRIERE – Examinateur
Pr Vincent LAGENTE –
Dr Zoltan ROZSNYAY –


Laboratoire E.P.H.E. de pharmacologie Cellulaire et Moléculaire. Institut de Recherche des Cordeliers,
15, Rue de l'Ecole de Médecine 75006 PARIS. Directeur : Mr le Pr Jean Chambaz.

Laboratoire Pfizer PGRD Fresnes. 3-9, Rue de la Loge BP 100 94265 FRESNES.
Directeur : Mr Gilles Spenlehauer.
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE


TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA ET PHOSPHOLIPASE A ETUDE DE DEUX2
MARQUEURS DE L'INFLAMMATION DANS LES PATHOLOGIES RESPIRATOIRES
INFLAMMATOIRES
EPHE Banque de Monographies SVT 1

LEPORTIER-COMOY Christelle

Le 19 décembre 2003




RESUME

Dans les premières étapes du développement de nouveaux candidats thérapeutiques en recherche pharmaceutique, il est
nécessaire de disposer de tests cellulaires et de modèles animaux pour pouvoir sélectionner les molécules efficaces. Dans ce
contexte, nous avons mis au point différents modèles ex vivo et in vitro basés sur l'induction du TNF-a par le LPS. Le TNF-a
est un acteur de l'inflammation présent dans les pathologies inflammatoires et respiratoires (asthme et BPCO) qui nous
concernent, et l'activité anti-inflammatoire de nouveaux composés tels que les inhibiteurs de PDE-4 est évaluée par leur
capacité à diminuer la production de TNF-a induite par le LPS. Parmi ces tests, le modèle sang humain est celui qui est le plus
adapté au criblage à haut rendement de nouvelles molécules car facile d'exécution et adapté aux études pré-cliniques.
Par ailleurs, la recherche de nouveaux bio-marqueurs est une préoccupation constante au niveau recherche et
développement pharmaceutiques, car ils sont nécessaires à la validation de la cible thérapeutique et ils permettent le criblage des
molécules. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à une enzyme, la PLA impliquée dans la génération de médiateurs2,
lipidiques inflammatoires (leucotriènes, prostaglandines) largement retrouvés dans l'asthme et la BPCO. L'étude de la relevance
de cette enzyme dans des modèles d'inflammation pulmonaire nous a permis de mettre en évidence son induction localisée au
niveau du parenchyme pulmonaire pour les modèles aigus et au niveau des LBA dans le modèle chronique. Ces résultats nous
ont conforté dans l'idée que la PLA semblait être un bio-marqueur potentiel, puisqu'elle pouvait être détectée et quantifiée2
d'une part et son induction était fonction du stade inflammatoire (modèle chronique) d'autre part. Sur la base de ces
observations, nous avons tenté de modéliser cette induction dans des tests in vitro utilisant le sang humain et des granulocytes
neutrophiles, ces derniers étant fortement impliqués dans les processus inflammatoires que nous étudions. Le sang humain ne
semble pas être un tissu adapté à ce type de modèle, en revanche les neutrophiles peuvent secréter de façon précoce de la PLA2
après stimulation. Des résultats préliminaires suggèrent que le rolipram présente une action inhibitrice sur la PLA induite dans2
ce modèle.

MOTS CLES : TNF-a, LPS, PLA , inflammation pulmonaire, inhibiteurs de PDE-4, bio-marqueur.2
TABLE DES MATIERES

LISTE DES ABREVIATIONS.............................. 1
INTRODUCTION........................................... 3
I L'ASTHME ET LA BRONCHO-PNEUMOPATHIE CHRONIQUE OBSTRUCTIVE
(BPCO), DEUX PATHOLOGIES INFLAMMATOIRES CHRONIQUES DU SYSTEME
RESPIRATOIRE................................. 3
EPHE Banque de Monographies SVT 2I-1 Physiopathologie.................................................................................................... 3
I-2 Prévalence............................................................................................................... 4
I-3 Facteurs étiologiques.......................................................................................... 4
I-4 Similitudes et différences................................................................................. 5
II IMMUNITE INNEE ET INFLAMMATION RESPIRATOIRE : ROLES DU TNF-a
ET DE LA PLA ............................................... 62
II.1 L'immunité naturelle ou innée............................................................................ 6
II.2 Le TNF-a, médiateur de l'inflammation.......................................................... 9
II.3 Les phospholipases A2 (PLA )........................................................................... 122
II.4 Les réactions inflammatoires dans l’asthme et dans la BPCO................... 17
III THERAPEUTIQUE DES PATHOLOGIES INFLAMMATOIRES
RESPIRATOIRES CHRONIQUES................................................ 21
III.1 Traitements actuels........................................................................................ 21
III.2 Les familles thérapeutiques potentielles................................................... 23
III.3 Les inhibiteurs de Phosphodiestérases de type 4 (PDE-4)..................... 24
IV ETAPES DE LA RECHERCHE DE NOUVELLES MOLECULES
THERAPEUTIQUES,ET INTERÊT DES BIO-MARQUEURS................. 25




EPHE Banque de Monographies SVT 3LISTE DES ABREVIATIONS



BPCO Broncho-pneumopathies chroniques obstructives.
BSA Bovine Serum Albumin (albumine de sérum bovin).
CI50 Capacité inhibitrice 50% : concentration d’un produit qui inhibe de 50% une
fonction donnée dans un essai.
cPLA Phospholipase de type A2, forme cytosolique.2
DTNB Acide 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoique (réactif d'Ellman).
DE50 Dose efficace 50 % : dose d’un produit administré à l’animal qui, soit induit
une réponse de 50 % d’une fonction donnée, ou a un effet spécifique sur 50.%
d'une population animale donnée.
EDTA Acide éthylène-diamine-tétra-acétique (chélateur de calcium).
EHNA Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adénine (inhibiteur de PDE-2).
ELISA Enzyme-linked-Immuno-Sorbent Assay.
fMLP Formyl-Méthionyl-Leucyl-Phénylalanine (peptide chimiotactique).
GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (facteur de croissance
des cellules souches hématopoïétiques).
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution (milieu de culture de Hank's).
Ig Immunoglobuline.
IgG (H+L) Immunoglobuline G (chaînes lourde et légère).
IL Interleukine.
i.c. Intra-cardiaque.
ICAM-1 Intracellular adhesion molecule-1 (molécule intracellulaire d'adhésion-1).
i.p. Intra-péritonéal.
2+iPLA Phospholipase A2 forme intracellulaire Ca -indépendante.2
i.v. Intra-veineuse.
JNK c-jun N-terminal kinase (facteur de trancription).
kDa Kilodalton.
LBA Lavage broncho-alvéolaire.
LMI Lean Median Intercept (diamètre moyen d'une alvéole en µm).
LPM Litre par minute.
LPS Lipopolysaccharide.
EPHE Banque de Monographies SVT 4MGG May-Grünwald Giemsa.
MMP Matrix metalloproteinase (métalloprotéinase de la matrice).
NFkB Nuclear factor kappa B (facteur de transcription).
PAF Platelet activating factor d'activation plaquettaire).
PBMC Peripheral blood mononuclear cells (cellules sanguines mononuclées).
PBS Phosphate buffered saline (tampon salin).
PDE-1 Phosphodiestérase de type I.
PDE-2 de type II.
PDE-3 de type III.
PDE-4 de type IV.
PDE-5 Phosphodiestérase de type V.
PDE-7 de type VII.
PLA Phospholipase A2.2
p.o. per os (administration par voie orale).
psig Unité de pression (1 psig correspond à 6,34kPa)
RNS Reactive nitrogen species (radicaux libres nitrés).
ROS oxygen libres oxygénés).
SEM Standard Error Mean (erreur standard à la moyenne).
sPLA Phospholipase A2 forme secrétée. 2
TNF