Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur

Molekularbiologische und biochemische
Untersuchungen zur
Avilamycin-Biosynthese und Resistenz in
Streptomyces viridochromogenes Tü 57



DISSERTATION

der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Eberhard-Karls-Universität Tübingen

zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften

1998
vorgelegt von

Sibylle Gaisser
























Tag der mündlichen Prüfung: 27. August 1998

Dekan: Prof. Dr. K.-A. Kovar
1. Berichterstatter: Prof. Dr. L. Heide
2. Berichterstatter: PD Dr. A. Bechthold
III



















Es ist eine trügerische Hoffnung, eine bessere
Welt schaffen zu können, wenn man nicht zuvor
die Einzelwesen besser macht. Um das aber zu
erreichen, muß jeder an seiner eigenen Vervoll-
kommnung arbeiten, da er durch seinen Anteil für
das Ganze mitverantwortlich ist.
Marie Curie Inhaltsverzeichnis I


Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................................................................2
2 EINLEITUNG..........................................................................................................................................4
2.1 Antibiotika im Wandel der Zeit...................................................................................................4
2.2 Resistenzmechanismen und ihre Verbreitung .............................................................................4
2.3 Wege zu neuen Antibiotika .........................................................................................................6
2.4 Voraussetzungen für die Kombinatorische Biosynthese.............................................................7
2.5 Polyketidsynthasen......................................................................................................................8
2.6 Die Gattung Streptomyces.........................................................................................................10
2.7 Genetik von Streptomyceten .....................................................................................................10
2.8 Streptomyces viridochromogenes - der Produzent des Orthosomycinantibiotikums Avilamycin11
2.9 Wirkmechanismus von Avilamycin A ......................................................................................13
2.10 Klonierungsstrategien................................................................................................................13
2.11 Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit ...............................................................................15
3 MATERIAL UND METHODEN.........................................................................................................16
3.1 Nährmedien ...............................................................................................................................16
3.1.1 Medium zur Kultivierung von E.coli...................................................................................................16
3.1.2 Medium zur Kultivierung von Bacillus subtilis...................................................................................16
3.1.3 Medien zur Kultivierung von Streptomyceten.....................................................................................16
3.1.4 Medium zur Protoplastentransformation von Streptomyceten ...........................................................17
3.1.5 Produktionsmedien .............................................................................................................................18
3.2 Antibiotika.................................................................................................................................18
3.3 Puffer und Lösungen .................................................................................................................18
3.3.1 DNA-Gelelektrophorese......................................................................................................................18
3.3.2 Sequenzierung.....................................................................................................................................19
3.3.3 Protein-Gelelektrophorese..................................................................................................................19
3.3.4 Transformation ...................................................................................................................................20
3.4 Chemikalienliste........................................................................................................................21
3.4.1 Enzyme................................................................................................................................................21
3.4.2 Medien-Bestandteile...............21
3.4.3 Chemikalien ........................................................................................................................................21
3.5 Stämme und Plasmide ...............................................................................................................22
3.5.1 Bakterien-Stämme................22
3.5.2 Vektoren..............................................................................................................................................22
3.5.3 Eigene Plasmid-Konstrukte ................................................................................................................23
3.6 Kulturbedingungen....................................................................................................................24
3.6.1 Anzucht und Kultivierung von E.coli ..................................................................................................24 II Inhaltsverzeichnis

3.6.2 Anzucht und Kultivierung von Streptomyceten ...................................................................................24
3.6.3 Antibiotika-Gradienten-Platte ............................................................................................................24
3.6.4 Herstellung einer Sporensuspension...................................................................................................24
3.6.5 Herstellung von Protoplasten .............................................................................................................24
3.7 Isolierung von DNA..................................................................................................................25
3.7.1 Isolierung genomischer DNA..............................................................................................................25
3.7.2 Plasmidisolierung ...............................................................................................................................25
3.8 Prozessierung von DNA............................................................................................................26
3.8.1 Restriktionsspaltung und Charakterisierung von DNA ......................................................................26
3.8.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel27
3.8.3 Ligation von DNA ...............................................................................................................................27
3.8.4 Transformation in E.coli.....................................................................................................................27
3.8.5 Transformation von Streptomyceten ...................................................................................................27
3.8.6 Erstellung einer Cosmid-Bank............................................................................................................27
3.8.7 Kolonie- und Southern-Hybridisierung ..............................................................................................28
3.8.8 PCR-Methoden....................................................................................................................................28
3.8.9 Konstruktion des Überexpressionskonstrukts .....................................................................................31
3.9 DNA-Sequenzierung .................................................................................................................31
3.9.1 Sequenzier-Reaktion ...........................................................................................................................31
3.9.2 Auswertung der Sequenzdaten ............................................................................................................32
3.10 Identifikation und Charakterisierung des Resistenzgens...........................................................32
3.11 Isolierung und Analytik von Sekundärstoffen ..........................................................................33
3.11.1 Isolierung von Avilamycin..............................................................................................................33
3.11.2 Agardiffusionstest...........................................................................................................................33