Autoantikūniai ant šunų eritrocitų ir trombocitų: nustatymas ir funkcinė svarba ; Auto-antibodies on canine erythrocytes and platelets: detection and functional significance
14
pages
Documents
2005
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
14
pages
Documents
2005
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
Doctoral dissertation was done in Lithuanian veterinary academy (LVA) and the Immunology Unit, School of Veterinary Medicine, Hannover (Germany) in LITHUANIAN VETERINARY ACADEMY 2000-2004. The right to confer doctoral degree was given to LVA together with Lithuanian Veterinary Institute by decision of Government of the Republic of Lithuania No. th 926, on 15 of July 2003. Dissertation is written in English. The research supervisor: Prof. habil. dr. Juozas Pieškus (LVA, biomedical science, veterinary medicine, 12B). Chairman of the defence council: Prof. habil. dr. Henrikas Žilinskas (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Gintar ė Ku činskien ė Members: Prof. at Incumbent, dr. Antanas Sederevi čius (LVA, biomedical sciences, AUTO-ANTIBODIES ON CANINE ERYTHROCYTES AND veterinary medicine, 12B); PLATELETS: DETECTION AND FUNCTIONAL Prof. at Incumbent, dr. J ūrat ė Šiugždait ė (LVA, biomedical sciences, veterinary SIGNIFICANCE medicine, 12B); Dr. Ar ūnas Stankevi čius (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Algirdas Šalomskas (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Opponents: Prof. at Incumbent, habil. dr.Saulius Petkevi čius (LVA, biomedical sciences, Summary of doctoral dissertation veterinary medicine, 12B); Prof. habil. dr.
Voir
LITHUANIAN VETERINARY ACADEMY
Gintar Ku č inskien AUTO-ANTIBODIES ON CANINE ERYTHROCYTES AND PLATELETS: DETECTION AND FUNCTIONAL SIGNIFICANCE Summary of doctoral dissertation Biomedical sciences, veterinary medicine (12B)
Kaunas, 2004
Doctoral dissertation was done in Lithuanian veterinary academy (LVA) and the Immunology Unit, School of Veterinary Medicine, Hannover (Germany) in 2000-2004. The right to confer doctoral degree was given to LVA together with Lithuanian Veterinary Institute by decision of Government of the Republic of Lithuania No. 926, on 15 th of July 2003. Dissertation is written in English. The research supervisor: Prof. habil. dr. Juozas Piekus (LVA, biomedical science, veterinary medicine, 12B). Chairman of the defence council: Prof. habil. dr. Henrikas ilinskas (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Members: Prof. at Incumbent, dr. Antanas Sederevi č ius (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Prof. at Incumbent, dr. J rat iugdait (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Ar nas Stankevi č ius (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Algirdas alomskas (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Opponents: Prof. at Incumbent, habil. dr.Saulius Petkevi č ius (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Prof. habil. dr. Vytas Antanas Tamoi nas (Institute of Immunology of Vilnius University, biomedical sciences, biology, 01B). Doctoral dissertation defence will take place on 5 th November of 2004 at the Lithuanian Veterinary Academy I a. 10 am LT. Address: Til s 18, LT-47181, Kaunas, Lithuania. The abstract of doctoral dissertation has been sent on 5 th of October 2004 according sealed listing. Doctoral dissertation is available in the libraries of Lithuanian veterinary Academy and LVA Veterinary Institute. 2
LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA Gintar Ku č inskien AUTOANTIK NAI ANT UN ERITROCIT IR TROMBOCIT : NUSTATYMAS IR FUNKCIN SVARBA Daktaro disertacijos santrauka Biomedicinos mokslai, veterinarin medicina (12B)
Kaunas, 2004 3
Darbas atliktas Lietuvos veterinarijos akademijoje (LVA) ir Hanoverio veterinarin s medicinos mokyklos Imunologijos laboratorijoje 2000-2004 m. Doktorant ros teis LVA kartu su Lietuvos veterinarijos institutu suteikta 2003 m. liepos m n. 15 d. LR Vyriausyb s nutarimu Nr. 926. Disertacija parayta angl kalba. Mokslinis vadovas: prof. habil. dr. Juozas Piekus (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B). Disertacija ginama LVA veterinarijos medicinos mokslo krypties taryboje. Pirmininkas: prof. habil. dr. Henrikas ilinskas (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B). Nariai: e. prof. p. dr. Antanas Sederevi č ius (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B); e. prof. p. dr. J rat iugdait (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B); dr. Ar nas Stankevi č ius (LVA Veterinarijos Institutas, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B); dr. Algirdas alomskas (LVA Veterinarijos Institutas, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B). Oponentai: e. prof. p. habil. dr. Saulius Petkevi č ius (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin medicina, 12B); prof. habil dr. Vytas Antanas Tamoi nas (VU Imunologijos institutas, biomedicinos mokslai, biologija, 01B). Disertacija bus ginama vieame Veterinarin s medicinos mokslo krypties tarybos pos dyje 2004 m. lapkri č io 5 d. 10 val. Lietuvos veterinarijos akademijos I auditorijoje. Adresas: Til s 18, LT-47181 Kaunas, Lietuva. Disertacijos santrauka isiuntin ta 2004 m. spalio 5 d. pagal patvirtint ą adres s ą ra ą . Disertacij ą galima peri r ti Lietuvos veterinarijos akademijos ir LVA Veterinarijos instituto bibliotekose.
4
VADAS Statistikos duomenimis, po irdies ir kraujagysli bei v ini susirgim autoimunin s ligos uima tre č i ą j ą viet ą pagal sergamum ą (Slauson and Cooper, 2002). un autoimunin hemolitin anemija (AIHA) bei trombocitopenija (AITP arba IMTP) yra taip pat vienos daniausi autoimunini un lig (Day, 1999a,c; Pedersen, 1999). Literat ros duomenimis, mirios citopenijos (eritropenija ir trombocitopenija), dar inomos Evans sindromo pavadinimu, aptinkamos 12-18 proc. pacient (Jackson and Kruth, 1985; Klag et al., 1993). AIHA/AITP apib dinamos eritrocit ar trombocit alinimu i organizmo d l ant j paviriaus prisijungusi autoantik n . Ta č iau i esm s autoantik nai negali b ti traktuojami tik neigiamai esant prastai fiziologinei organizmo b senai, jie b tini i organizmo senstan č ioms l ą stel ms alinti. Nedaug fiziologini autoantik n organizme aptinkami ir ant sveik eritrocit bei trombocit . Iki iol n ra nustatyta koreliacijos tarp prie l ą steli prisijungusi patologini autoantik n kiekio bei eritrocit ar trombocit alinimo in vivo . Yra duomen , kad net nedaug prie min t l ą steli prisijungusi autoantik n gali sukelti autoimunines citopenijas (Garratty, 1991). Tod l AIHA ir IMTP diagnostikai naudojami tyrimo metodai turi b ti ne tik pakankamai jautr s, bet ir pad ti atskirti ant l ą steli esan č ius fiziologinius antik nus nuo patologini . Iki iol daugelyje medicinos bei veterinarijos diagnostikos laboratorij AIHA diagnozuoti naudojamas tiesiogin s agliutinacijos metodas (DAT, dar vadinamas Coombs metodu) aptinka tik 38-58 proc. AIHA atvej (Melinda et al., 2000; Wilkerson et al., 2000). Tod l io darbo vienas i tiksl buvo parengti jautresnius AIHA tyrimo metodus: sustiprint ą tiesiogin ę agliutinacij ą (eDAT) bei membranos imunofluorescencij ą (MIF) su eritrocitais, naudojant plat spektr ą antik n prie uns vairius imunoglobulinus bei tre č i ą j komplemento komponent ą . Kadangi autoimunin s citopenijos (AIHA/IMTP) danai sukelia komplikacijas ar diagnozuojamos kartu su kitomis ligomis, vienas i darbo tiksl buvo isiaikinti cirkuliuojan č i imunini kompleks (CICs) kiekio pakitimus AIHA/IMTP sergan č i pacient kraujyje.
5
Paskutinieji moksliniai tyrimai parod , kad sergan č i vairiomis v io formomis un serumuose yra mononuklearin ms l ą stel ms citotoksini mediag (Rösner, 2004). Du tre č daliai vis tirt v iu sergan č i un serum buvo citotoksiki pagrindin ms efektorin ms un imunin s sistemos l ą stel ms. Kadangi beveik visuose min tuose tyrimuose serumuose buvo aptikta autoantik n prie l ą steli citoplazmos bei branduolio strukt ras, iame darbe taip pat siek me isiaikinti AIHA/IMTP sergan č i un serum citotoksin potencial ą . Darbo tikslas Nustatyti autoantik nus ant un eritrocit bei trombocit bei vertinti nustatyt autoantik n funkcin ę reikm ę AIHA/IMTP patogenezei. Ikelti udaviniai 1.Parengti jautresnius AIHA diagnostinius metodus, naudojant polikloninius bei monokloninius antiserumus prie skirtingas un imunoglobulin klases bei j poklasius ir komplemento tre č i ą j komponent ą : a) sustiprint ą (modifikuot ą ) tiesiogin ę agliutinacij ą (eDAT); b) eritrocit membranos imunofluorescencij ą . 2.Ianalizuoti Evans sindromo dan pacientams, kuriems ant eritrocit ar trombocit buvo nustatyti autoantik nai. 3.Nustatyti cirkuliuojan č ius imuninius kompleksus AIHA/AITP sergan č i pacient serumuose ir vertinti anemik bei trombocitopenik un citotoksin serum poveik uns leukocitams in vitro . 4.Charakterizuoti nespecifikai su uns eritrocitais bei trombocitais reaguojan č ius monokloninius antik nus prie moni leukocit diferenciacijos antigenus (CD). Naujumas ir praktin reikm iuo darbu mes rod me, jog membranos imunofluorescencijos (MIF) metodas yra daug jautresnis nei tiesiogin agliutinacija (DAT ar Coombs ), aptinkant autoantik nus ant eritrocit . Pateikiame si lym ą , 6
kaip tiksliau ir aikiau vertinti bei interpretuoti MIF tyrimo su eritrocitais rezultatus. Iki i dien Evans sindromo (kai pacientui kartu diagnozuojama ir trombocitopenija, ir anemija) paplitimas tarp un n ra tiksliai nustatytas. M s tyrim duomenimis, Evans sindromas ap m 14,4% vis d l AIHA ir AITP tirt pacient . Naujum ą iam darbui suteikia ir AIHA/AITP pacient tyrimas d l serumuose cirkuliuojan č i imunini kompleks (CICs). Iki iol mokslin je literat roje n ra duomen apie pakitus CICs kiek AIHA ir AITP lig atvejais. Netyrin tas ir AIHA/AITP sergan č i pacient serum citotoksinis potencialas, kuris gali daryti tak ą uns leukocit funkcijoms, o per juos ir imuniniam organizmo atsakui antigen ą . Pamin ti nauji AIHA diagnoz s bei AIHA/AITP patogenez s aspektai n ra b dingi tik unims. Iki iol medicinoje esmini diagnostikos bei patogenez s skirtum AIHA/AITP atvejais tarp moni ir un nepasteb ta. Taigi ne tik daug jautresni diagnostikos metodai bei j vertinimas ir interpretavimas, bet ir nauji duomenys apie CICs ir serum citotoksikum ą leis pateikti praktikams naujas min t lig gydymo koncepcijas. Be jau min t darbo naujumo aspekt , nustat me, kad kai kurie monokloniniai antik nai (CD42a, CD9, CD29, CD61, CD41/CD61, CD235) prie moni CD reaguoja su un trombocitais ir eritrocitais. Min ti monokloniniai antik nai gali b ti panaudojami tolesniems eritrocit ir trombocit pavirini strukt r tyrimams. Darbo strukt ra ir apimtis Disertacij ą sudaro vadas, literat ros apvalga, tyrim ir metod apraymas, gaut rezultat id stymas, rezultat apibendrinimas, ivados, publikacij s ą raas, pad ka asmenims, pad jusiems perprasti tyrim metodus bei vertinti ir interpretuoti duomenis, darbo santrauka. Darbe pateikiama: 25 lentel s, 20 paveiksl . Viso darbo apimtis 106 puslapiai. Darbe naudotasi 216 literat ros altini . TYRIM METODAI IR MEDIAGOS Atliekant darb ą d l skirting AIHA/AITP patogenez s aspekt i viso buvo tirti 5598 unys. Kraujas imtas i 1-14 m. amiaus un : 7
69 proc. vis tirt un sudar patinai ir 31 proc. patel s. Kontrolini grup ę sudar sveiki 2-14 m. amiaus unys (45 proc. patin ir 55 proc. pateli ). Tirt m gini skai č ius pagal darbe naudotus tyrimo metodus Tiriamoji Kontrolin Tyrimo pavadinimas grup (n) grup (n) Tiesiogin agliutinacija (DAT arba Coombs ) 3881 trMoemmbborcaintaoiss imunofluorescencija (MIF) su 691 1 1488 Evans sindromo tyrimas 557 557 MIF su eritrocitais 24 13 DAT ir irykintos tiesiogin s agliutinacijos (eDAT) 24 13 palyginimas Netiesiogin s agliutinacijos ir MIF su eritrocitais palyginimas 9 5 Cirkuliuojantys imuniniai kompleksai (CICs) 18 8 Citotoksikumo (Methyl-Thiazol-Tetrazolium) tyrimas 27 11 MIF su eritrocitais ir monokloniniais antik nais 31 42 s ir mon ms specifikais mMoInF oskul oerniitnrioaciist aaintik nais 5 I viso: 6262 2142
8
AIHA Tiesiogin s agliutinacijos metodas (DAT arba Coombs ) AITP eritrocitai (RBCs) Membranos imunfluorescencijos metodas tro(mMbIoFc)i,tai Evans sindromas MIF su trombocitais + DAT su RBCs Cirkuliuojan č i imunini kompleks metodas (CIC ) , serumo m giniai
Sustiprinta DAT-Netiesiogin DAT-MIF, RBCs MIF metodas Monokloniniai antik nai, RBCs
Kraujo m giniai Tirtas kraujas (2 ml m gintuv liuose su 120 μ l 15 proc. EDTA; Becton Dickinson, Vokietija) imtas i anemik /trombocitopenik pacient . Kraujo m giniai buvo atsi sti Imunologijos laboratorij ą (Veterinarin s medicinos mokykla, Hanoveris, Vokietija) itirti d l autoimunin s hemolitin s anemijos ar trombocitopenijos. Eritrocit ruoimas tyrimams Eritrocitai kelis kartus praplauti su izotoniniu fosfatiniu druskos buferiu (PBS, Seromed, Vokietija) (200 x g, 5 min). Po plovimo koncentruoti eritrocitai skiesti 1:40 terpe RPMI1640 (su 2 proc. inaktyvuotu fetaliniu verelio serumu (FCS), atskiestu 1:5 su PBS). 9
Citotoksikumo metodas (MTT) , serumo m giniai
